土佐房昌俊原本是大和国兴福寺金刚堂的僧人,因为年供问题与大和国针之庄的代官发生了冲突,因而认识了在京都担任警卫工作的土肥实平。随后在土肥实平的带领下来到关东参见了源赖朝,并由此成为了源赖朝的家臣,并且作为源赖朝的御家人参加了承治、寿永之乱。 文治元年(1185年)源赖朝与弟弟源义经产生了对立,10月9日源赖朝在御家人中询问有谁可以进京刺杀源义经,土佐房昌俊毛遂自荐承担了这个任务,得知这个消息的源赖朝大喜过望。土佐房昌俊出发前,源赖朝在下野国中泉庄与土佐房昌俊见了面,见面时土作坊昌俊请求源赖朝照顾自已的老母和幼子,源赖朝一口应承了下来。
土佐房昌俊和弟弟三上弥六家季率领83人从镰仓出发,10月17日夜对源义经的在京都的住宅六条室町亭发起袭击。源义经的部下被打了个措手不及,源义经和佐藤忠信一起亲自提刀和刺客展开厮杀。不久之后,驻扎在附近得到消息的源行家部队赶来支援源义经,土作坊昌俊这才被击败退往鞍马山,途中被源义经的部下赶上并生擒。10月26日土作坊昌俊和其被俘的家人一起在六条河原被斩首。源义经被袭击的第二天,即10月18日,后白河法皇发布了讨伐源赖朝的宣旨,源义经奉旨召集人马准备与源赖朝开战。