cRNA探针是以cDNA为模板在体外转录而成的探针，可方便地通过已克隆于特定质粒载体的DNA产生。这些质粒通常在紧邻多克隆位点的位置含有一个噬菌体启动子。应用相关的RNA聚合酶和4种核糖核苷(rNTPs)(其中至少一种带有标记物)进行体外转录反应，依赖DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA为模板，以含有标记物的三磷酸核糖核苷为原料，从启动子下游开始在体外转录产生RNA。通过改变外源cDNA在质粒中的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向(即以cDNA的哪条链为模板转录RNA)，从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(senseprobe)或与mRNA互补的反义RNA探针(antlsense probe)，后者即互补RNA(cRNA)探针。通常用同义RNA探针作cRNA探针的阴性对照。