糖解作用

在糖解作用中，此分子是2-磷酸甘油酸在烯醇化酶（enolase）的催化下生成，是一个高能磷酸分子。接下来磷酸烯醇丙酮酸将会进入糖解作用的第10个，也是最后一个步骤中。

在糖解作用的最后步骤里，磷酸烯醇丙酮酸将会经由丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根转移到ADP上，进而生成ATP以及丙酮酸。这个反应会放出大量的能量，是一个难逆的反应，其标准自由能变化是31.4 kJ/mol（在pH=7、浓度55.5M的水中）。此外，这个反应也需要钾离子与镁离子（或其他二价阳离子）的参与。

糖质新生

由于糖解作用的最后步骤是个难逆反应，因此在糖质新生的过程中，需要一个替代途径，才能将丙酮酸还原成磷酸烯醇丙酮酸。首先丙酮酸必需要先在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的催化之下，消耗ATP分子并转变成草酰乙酸（Oxaloacetate）。

之后草酰乙酸又会经由磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）的催化，生成磷酸烯醇丙酮酸，在这个反应中，会消耗掉ATP，并生成ADP与二氧化碳。

与前后反应不同的是，以上的两个反应是在线粒体中进行。而且除了直接转变之外，草醋酸还可以利用另一个需要更多步骤的途径，来生成磷酸烯醇丙酮酸。此外，从磷酸烯醇丙酮酸的生成直到果糖-1,6-双磷酸产生为止，中间的糖质新生过程皆是糖解作用的逆反应。

二氧化碳固定

在C4植物中，磷酸烯醇丙酮酸在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的作用下与二氧化碳反应生成草酰乙酸。

参考资料David L. Nelson & Michael M. cox. Lehinger. Principles of Biochemistry. 4th edition. Freeman. ISBN 0-7167-4339-6.Lubert Stryer原着；曾国辉编译。《大学生物化学》。艺轩图书出版。ISBN 957-616-120-7。