正文

技术原理

从生物样本，如组织、血液、痰液中提取核酸（DNA、RNA），制备相应的模板、引物，进行多重PCR，然后采用凝胶电泳、PAGE电泳、HPLC、DHPLC、毛细管电泳等方法中的一种进行DNA片段分析，最后将获得的数据进行处理。

先进片段分析（Advanced fragment analysis，AFA），是片段分析中较为领先的技术。原理是设计针对不同目标靶点的引物，每个靶点扩增得到的产物至少有1bp以上的差别。交第三方合成引物并在末端标记荧光，不同大小片段采用不同颜色荧光标记，进行多重聚合酶链反应（PCR），使得所有靶点的核酸片段都带荧光标记（图A）。产物预处理后，进行毛细管电泳，利用荧光检测器对不同片段大小的产物进行识别和区分（图B）。使用软件分析数据来决定以下结果：

1）大小：分析软件利用每种样品中的标准尺寸为每种样品创建一条标准曲线，

然后通过荧光标记片段与标准曲线的比较获得片段的相对大小。

2）基因型：分析软件根据用户自定义的基因位点来分配等位基因。

FA操作过程

FA发展历史

a) 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。迁移速度与核酸分子本身的大小和构型有关，相同电场强度下，分子量较小的DNA分子迁移较快。

琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率虽比PAGE电泳低，但它制备容易。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。装置如图所示：

1.PAGE电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，简称PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶为三维网状结构，具有分子筛效应。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

1.HPLC|DHPLC

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography \ DHPLC），在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。

DHPLC是一种基因突变筛查技术，能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。DHPLC灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉。检测每个样品只需要8分钟左右，且能够纯化DNA片断。只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是可以通过纯合突变样品和野生型样品混合的方法来解决。

1.毛细管电泳

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平。

毛细管电泳通常使用内径为25-100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。具有：高效、快速、微量、仪器简单、易自动化、操作方便、应用范围广等优点。

FA技术特点

传统的基因片段分析建立在凝胶电泳基础上，利用片段大小以及电荷不同对核酸产物进行分离和分析，尽管应用普遍、成本较低，但是却存在以下缺点：操作繁琐；分辨率低，无法精确度量基因片段的碱基数；有EB污染，严重危害人类健康。

先进FA检测技术的核心内容是多重PCR技术以及毛细电泳系统分离。在同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合相应的目的基因，进行多重PCR；通过毛细管电泳系统可对不同片段长度的PCR产物进行分离和识别，同时，根据峰面积的大小还可对不同产物进行定量分析。先进FA包含以下几种先进的技术：

1.高特异性等位基因多重分析（Multiplexing Allele Specific Assay, MASA）：能在一个反应中同时分析多达15个SNP位点，可用于药物基因组学分析；

2.高灵敏度高特异性病原体分析（High Sensitivity Pathogen Specific, HSPS）：在一个反应体系里面同事检测与识别多个低拷贝数的病原体，用于感染性病原体的多重检测。

传统PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。

多重PCR特点：①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。

毛细管电泳特点：容积小（一根100 cm×75 μm 管子的容积仅4.4 μL）；侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。

由此，可使毛细管电泳具备如下优点：

（1）高效：塔板数目在10-10 片/m 间，当采用CGE 时，毛细管电泳色谱图，塔板数目可达10 片/m 以上；远高于高效液相色谱；

（2）快速：一般在十分钟内完成分离，快的仅需三分钟；

（3）微量：进样所需的样品体积为nL 级；

（4）仪器简单、易自动化；

（5）操作方便；

（6）应用范围广。

与直接测序相比：某一个基因位点是比较容易得知的，但要获得一段完整的基因序列就很困难，若是得不到就无法进行直接序列比较。而如果标记离基因位点很近，那么可以通过标记分析推断出突变基因的存在。标记分析要比直接基因测序快很多。

FA相关应用介绍

a) 临床方面

i. 病原微生物

片段分析能够准确、快速地检测出致病的病原微生物。

按照疾病传播途径的不同，大致可以分为：虫媒、呼吸道、寄生虫、接触、胃肠道、血液等。片段分析在这几类疾病的病原微生物诊断应用中的成效显著。例如，Jian Li, Yanhui Zhang等人研究了疟原虫的简单重复序列（SSRs），区分了近600种用多态微卫星标记的约氏疟原虫基因组。

除了对传播疟疾的疟原虫的研究，片段分析还被广泛地用于呼吸道疾病的研究，如麻疹病毒、致肺结核的分支杆菌、水痘病毒、H1N1流感以及鸡瘟病毒等。Maria A. Nagel, Don Gilden等人运用逆转录PCR技术和基因图谱分析系统（GeXPS）以及毛细管电泳和荧光分析技术，克服了宏阵列和微阵列分析不能检测潜伏在人神经中枢的水痘带状疱疹病毒（VZV）基因的缺点，该技术能够快速分析VZV在人神经系统潜伏期时的所有基因转录。除了上述几位研究人员，Meng Qin, Da-yan Wang等人也运用了GeXP基因分析系统研究了H1N1流感病毒，研究发现该方法具有较高的灵敏度和特异性，并且该法可以用来检测潜伏的混合感染，为流行性感冒的监管提供了强有力的方法，同时也提供了一个研究相似病原体变异的平台。而Jin Li, Nai-Ying Mao等人运用多重逆转录PCR技术和GeXP系统，对16种人呼吸道病毒进行了同时检测，结果显示这是一种快速的、高成本效益的、灵敏的、具有特异性且高通量的检测呼吸道病毒感染的方法。

片段分析在寄生虫方面也有研究应用。如利什曼虫， Rolando Oddone,Carola Schweynoch等人运用多位点微卫星分型分析技术（MLMT）根据15个独立位点来识别利什曼虫，结果证明MLMT适用于利什曼虫亚属的流行病学和菌株群体遗传学的研究。

通过接触传播的如腺病毒、人乳头瘤病毒（HPV）等。低危性HPV引发扁平疣、寻常疣等疣，高危性HPV引发阴茎癌、宫颈癌、直肠癌等癌症。Meng-Jie Yang, Le Luo等人采用多重PCR和GeXP分析仪对11种人乳头瘤病毒（其中包括9中高危型和2种低危型）进行检测，结果表明GeXP-PCR是一种快速、高灵敏度、高通量的检测多种HPV感染的方法。国内也有人运用GeXP-PCR对HPV进行检测，如芦春斌，杨梦婕等人利用该技术对5种不同亚型的HPV病毒进行检测鉴别。

胃肠道传播疾病方面研究如与手足口病的肠道病毒相关的检测。目前已有的检测方法有实时逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、内嵌套式PCR、限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应（PCR-RFLP），这些方法都能够鉴别不同血清的肠道病毒，然而实时RT-PCR和内嵌套式PCR只能检测有限数量的血清，PCR-RFLP尽管能够同时检测多个血清样本，可是价格却比较贵，也很耗时耗人力，因此Xiumei Hu, Yong Zhang等人研究认为GeXP分析法是一种快速、低成本、高通量区分9种手足口病肠道病毒血清型的方法。

通过血液传播的疾病如艾滋病、乙肝、丙肝等。它们均是由病毒引起的疾病，通过片段分析来检测艾滋病病毒（人体免疫缺陷病毒HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等病毒的研究也有不少。肖信研究建立了用于广西HIV-1流行毒株的实时荧光定量PCR方法，并对方法科学性进行评价，结果表明荧光定量PCR方法具有线性范围广，特异度高，重复性好，检测下限低，检测试剂稳定性好，并与国际标准的NASBA法检测结果高度相关，与国内标准的试剂盒产品具有较好的一致性，能适应广西地区不同HIV-1亚型；该方法实用、可行，在病毒载量检测、早期感染检测、治疗病人的耐药监测等方面具有良好的应用前景。尹菊囡采用多重巢式PCR技术研究构建一种快速、经济、实用、可靠的同步检测HBV、HCV和HIV-1的方法，结果表明该方法可同时检测HBV、HCV和HIV-1,但其灵敏度和特异度需进一步鉴定。李桂明采用磁珠提取核酸技术建立了一种能同时检测、鉴定和定量三种病毒的多重实时定量RT PCR检测方法，将这种方法的灵敏度与Qiagen公司的病毒DNA和RNA提取试剂盒进行比较，结果表明它们有很好的相关性；且一种病毒核酸的扩增不会对其它两种产生影响；该检测体系具有很高的灵敏度，最低可达50拷贝/ml；与单重的检测相比也显示出很好的相关性；表明这种检测体系有大规模用于献血筛查的潜力。

ii. 个体化用药

个体化药物用药是根据病人的年龄、身高体重、遗传特征等因素，选择适合病人的药物种类和剂量，来显著提高药物疗效并减少药物毒性的一种用药方案。

统计数据表明，绝大多数药物在约1/3的使用者中不能取得满意疗效，约1/6的使用者发生不同程度的不良反应，总的安全有效率仅约50%。目前药物不良反应是人类第五大死亡原因。为在基因组学的基础上，通过将基因表达或单核苷酸的多态性与药物的疗效或毒性联系起来，研究药物如何由于遗传变异而产生不同的作用，被称为药物基因组学。迄今已有100余种药物经美国FDA批准贴上了遗传标签，用于提示不同基因型的患者在应用该药物时可能产生的疗效和毒性。因此，通过基因检测可针对性地为每位患者“量身定做”一套最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的有效率，减少药物的毒副作用，避免用药不当贻误时机。

片段分析技术被广泛应用于肿瘤领域，包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌等。有卵巢癌病史的家族中常伴随着BRCA1以及BRCA2基因突变，Herman等人通过多重连接探针扩增技术（MLPA ）分析BRCA1基因，对产物大小进行分析，意外的发现了在该基因的外显子11有一段374bp的序列缺失，然而用传统的测序法并未发现该现象。Pham等人通过小发夹状RNA干扰乳腺癌干细胞的CD44，利用多重PCR结合片段分析法，经GeXP遗传分析仪对干细胞相关基因的基因表达水平进行了研究，发现通过干扰CD44，会使得乳腺癌干细胞向非乳腺癌干细胞分化，基因表达水平也更相似，这为乳腺癌的治疗提供了一种新的潜在的治疗方法。Sadava等人研究灵芝对小细胞肺癌的疗效，利用GeXP基因表达分析系统对与细胞循环及细胞凋亡相关的36个基因进行了分析，发现其中经灵芝处理后的9个基因的表达水平与经化疗药物依托泊苷以及阿霉素治疗后的不同。Dahan等人通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术以及CEQ的分型研究了与用于治疗结肠直肠癌的西妥昔单抗药效相关的潜在基因EGFR、EGF、CCND1、FCGR2A和FCGR3A的多态性，研究发现FCGR3A F158V以及CCND1 A870G的多态性对预测药效、总生存数具有独立重大的意义。Drew等人利用GeXP多重基因表达分析系统、微阵列芯片法及实时荧光定量法对结肠普通组织、息肉及肿瘤组织的炎症相关基因的表达水平进行了研究，结果表明GeXP表达谱分析法可实现同时对多个基因表达进行定量，相比实时荧光定量PCR方法，它更快速、价格更低，同时多个内参基因能确保基因表达水平的准确性。

在心血管疾病方面，也有用到片段分析方法进行相关研究。肾胺酶抗体具有血流动力学效应，它很可能参与调节心血管功能，Buraczynska等人通过PCR-RFLP方法对肾胺酶抗体基因上的3个SNP位点进行基因分型发现该基因的多态性与糖尿病第二类患者的高血压相关，并发现rs10887800的等位基因G很可能会增加糖尿病患者中风的风险。LDLR基因的突变是家族性高胆固醇血症最常见的病因，而大片段基因重组在LDLR基因突变中所占比例高达10%，Goldmann等人利用MLPA方法首次发现非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）参与LDLR的基因重组。Botto等人利用测序并结合PCR-RFLP方法，研究LMNA基因的突变，该基因突变与扩张型心肌病密切相关，研究发现了在最常见的R190W突变旁边有一类新的错义突变R189W。张阳东等人还通过GeXP平台对冠心病相关基因表达分析中的管家基因的表达水平进行了比较，并提出β-actin和SRP14可作为检测CAD相关基因表达水平的内参基因。宁波海尔施基因科技有限公司也非常关注心血管疾病相关研究，在AFA技术上开发了多项专利，如“一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法”已被授权，通过对药物靶标及参与药物代谢等基因的遗传多态性的诊断，用于华法林抗凝的安全性指导；同时，还开发了针对β-受体阻断药用药、噻嗪类利尿药降压药以及血管扩张药硝酸甘油的多重基因检测试剂盒，目前正在审核过程中。

片段分析方法还被用于其它疾病的研究，如淋巴细胞性白血病、肌萎缩、抑郁症等。

iii. HLA分型

在组织或器官移植中供者与受者之间相容(不排斥)还是不相容(排斥)都是由它们组织特异性所决定的。这种代表个体特异性的组织抗原称组织相容性抗原，一套这样的抗原系统称主要组织相容性系统(major histocompatibility system,MHS)。编码MHS的基因群称为主要组织相容性复合体MHC。人的MHC就称HLA(human leukocyte antigen)，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体。 HLA包括有I类II类和III类基因部分。实践证明，HLA相同的同胞供者的肾移植，90%以上效果良好；单体型不同的供者，效果明显下降；两单型皆不同者则很少存活。

以往，用于HLA分型的方法主要是血清学和细胞学方法，由于其方法学上的缺点，分型的准确性较差，且不能进行亚型分析。最近几年，随着分子生物学的不断进步，特别是PCR技术的广泛应用，HLA基因分型技术得到了迅速的发展，各具特点的不同HLA基因分型技术不断出现，在方法学上达到了稳定、准确、精细、简便、实用的程度，为其临床推广应用奠定了技术基础。邬于川等人应用PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）方法进行了HLA-DP B1 等位基因与四川汉族人哮喘的相关性研究。黄飞等人进行PCR-SSP(序列特异性引物)/PCR-SBT-HLA(直接测序分型) 高分辨等位基因分型比较，发现两种方法具有实验互补意义。若同时应用两种方法能够有效改善HLA 等位基因高分辨分型的准确性和重复一致率。

值得注意的是，目前临床用血多为成分输血，成分血分离自全血，不可避免会残留少量白细胞或血小板。而有核细胞或血小板表面存在的HLA会随着输血进入患者体内，异体HLA抗原可对患者的HLA分型判定产生干扰。现报道1例接受过多次大量成分血输注治疗的重型再生障碍性贫血患者，由于未严格按HLA分型血标本规定时间间隔进行血标本采集，导致HLA低分辨基因分型结果无法判定。

1.亲权鉴定

古代滴血认亲的方法，造成了不少冤案。如今，有了片段分析法，就可以快速、准确的鉴定亲权关系。

杨玉发等人，采用PCR复合扩增技术、毛细管电泳及五色荧光自动化检测技术对143例亲权鉴定案例389份血液样本，进行了15个STR基因位点和1个Amelogenin性别基因位点检测分析，得出结论：STR基因检测位点多，多态性高,DNA片段短、造成错配和优先扩增的可能性小，提高了PCR扩增的成功率和灵敏度，而且标本用量少(一般仅为0.1ng模板DNA),因此,STR基因位点检测技术可以作为亲权鉴定的主要技术手段。潘猛等人，取2011~2012年来自江苏省的262份无血缘关系的汉族个体，对24个STR位点进行复合扩增,ABI3130自动基因分析仪进行片段分析并进行基因分型，分析了24个Y染色体短串联重复序列(STR)基因座在江苏汉族群体的基因多态性、基因频率和其他地域人群之间的遗传距离。

1.其他方面

产前诊断、个体识别等