测定方法

出血时间测定有三种方法：即，Duke法、Ivy法、出血时间测定器法。

Duke法

Ivy法

出血时间沉定器法

临床意义

1.

2.

3.

时间测定

凝血时间试验是指血液自血管抽出放入试管中，从液态的溶胶状态转为半固体凝胶状态所需要的时间。出血后，血液(或血浆)中的Ⅻ因子被激活后，处于酶原状态的凝血因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅴ依次被激活，连续"放大"，最终使纤维蛋白原生成纤维蛋白。后者呈网状结构，网罗血小板栓子和红细胞后，收缩形成牢固的血块。这一过程需要Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ca2+、凝血酶原及纤维蛋白原等凝血因子的参与，其中任一因子缺乏均可引起上述"连续放大"过程障碍，造成凝血不良。因此凝血时间延长，可反映上述因子缺乏。此试验反映记录的是整个凝血过程，对Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子较为敏感，只有凝血酶原,凝血因子X,纤维蛋白原明显减低时才显示实验结果延长。

凝血时间实验大致有6种测定方法。王鸿利等用6种凝血时间测定对12例重型血友病（Ⅷ因子活性<1%），4例中型血友病（Ⅷ因子活性1%~5%）进行测定，结果（检出率/病例数）为：毛细血管法，重型1/12，中型0/4；玻片法，重型2/12，中型0/4；普通试管法，重型12/12，中型2/4；APTT，重型12/12，中型4/4；硅化管，重型12/12，中型4/4；ACT法，重型12/12，中型4/4。从中可以看出，毛细血管法和玻片法很不敏感，不能再用于Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ因子的筛选实验。普通试管法简单且较敏感，标本用量较少，可用于常规检查，但由于手工操作，需注意实验器材的标准化。APTT简便快速，市面上有各型凝血仪，可用于不同规模实验室，且有配套的试剂、质控物、校准物，易于质量控制，是较理想的常规实验方法。APTT也可手工完成，但影响因素较多，在标本量较多时，不适用。

临床意义

1.

2.

指标诊断

为了避免术中出血，手术前进行出血倾向的检查非常必要，由于影响止血的因素很多，但又不可能做许多实验，因此，以往常规中用出血时间和凝血时间作为诊断指标，结果异常时再进一步做较复杂的试验寻找病因。前已述及,Duke法虽简单适于常规应用，但敏感性很差，不能达到诊断要求，而出血时间测定器方法，操作复杂，费时，不适合常规使用。虽是反映血管，血小板数量和质量方面的病理变化，但临床最常见的是血小板减少引起变化。而血管性疾病和血小板质量异常引起的疾病多是遗传性疾病,发病率很低，且基本上能在临床表现，体征和病史中反映出来，可提示做一些确诊试验。从这个意义上讲，手术前只要做一项血小板计数而不做出血时间，也基本上能保证手术前筛查的要求。

APTT法仅对凝血阶段Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子敏感。为此，在进行APTT检测同时还应再检查PT,以保证能检出由于凝血酶原,Ⅴ因子,Ⅵ因子缺乏而引起的出血倾向。

注意事项

1.PT,APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管.

2.凝血实验标本最好不与其他实验一起采集，否则由于标本的分配，分装等使用血液停留在针管的时间延长。一般血液采集，进入容器至进行实验所用的时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取出血的做法不可取.

3.取血时病人应松弛，环境温暖，防止静脉挛缩,止血带的压力要尽可能小，压力大及束缚时间长可影响局部血液的浓缩和内皮细胞释放组织纤溶酶原活物(t-PA),后者将引起纤溶性增强，血小板短和内径应标准化，国际上推荐用21G1.5或20G1.5针头。取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平稳地进入注射器，防止气泡的产生.

4.一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合，一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根据取血量设计，有2.0,5.0,10ml各种血液收集管，真空负压并有定量的抗凝剂，能保证抗凝剂与取血量的比例，且能有充分的空间便于血液和抗凝剂混合.

5.用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内.

6.采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。笔者曾对不同条件保存的血浆因子变化进行了探讨，结果显示在32℃保存血浆6,12,24hⅧ因子活性可分别消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分别消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分别消失25,40,80%,而在4℃则仅损失0%,5%,10%.因此测定APTT的血浆在-80℃至少可保存1个月,4℃为6h,20℃为6h,而32℃仅为血浆，在4℃为24h,20℃为6h,32℃为2h.

7.国际血液学标准化委员会(ICSH),国际血栓与止血委员会(ICTH)推荐使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mol/L的枸橼钠作为凝血因子检查的抗凝剂。另外，近年来，许多试验室采用缓冲抗凝剂，这种试剂对标本经冷冻保存后再行分析更为适宜。因为无缓冲剂，血浆pH值随时间而增加，凝固时间可延长，特别是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可减少50%.缓冲剂的作用是维持血浆恒定pH,防止易变因子失活。抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，一定要注意采血时血液与抗凝剂的比例。应指出，所谓血液与抗凝剂按9:1比例混合，实际上是指抗凝剂与正常压积血液之间的比例而言。因此应根据患者红细胞比例(Hct)状况随时调整抗凝剂用量.

1.凝血活酶应注意的问题:

(1)组织凝血活酶标准化应用的国际参考品(internationalreferencepreparation,IRP),有下列几种：单一组织凝血活酶国际参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂.WHO在英国使用的统一标准的"英国比较凝血活酶",编号67/40.同时又以BCT67/40为基础标准化了次级参考品。如牛脑组织凝血活酶，编号68/434;兔脑为70/178等.复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量纤维蛋白原,因子V和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等.

(2)组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数(ISI),由于不同组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同。为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。自制的试剂要与国际参考品(IRP)进行比较，然后得出一个校正值(即ISI).ISI值越接近于1.0,表明组织凝血活酶试剂越敏感，因此,生产和出售得产品必须标有ISI.

(3)仪器特有的ISI:上述PT根据报告方式适用于手工法(试管倾斜法)测定PT.但是手工法与仪器法以及仪器法与仪器法测定PT的国际标准化比值(INR)之间，仍有差异。为此，专家们提出建议：同一组织凝血活酶试剂用于不同仪器时，可用所谓的"仪器特有的ISI"或称区域性ISI来计算INR.每台仪器所用的凝血活酶试剂都应该有特定的ISI值，重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆，然后在自己的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值，这样才可使病人的INR具有可比性.

(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶并不一定与某此仪器相匹配。浑浊的或含微粒的凝血活酶和部分活化凝血活酶不能运用通过光学系统测定终点的仪器进行检测.

(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行。通常在使用前必须充分混匀试剂，以使微粒重新均匀悬浮于液体中。按说明书要求的温度存放试剂，并且试验过程中，将试剂置于37℃下的时间不能长于说明书中规定的温度.

(6)做APTT实验时所用的活化剂不同，对血内肝素,狼疮抗凝物质及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏症的敏感性也不同，要根据检测项目来选择不同活化剂的APTT试剂。同样PT延长时反遇有关凝血因子中单一因子或几个因子缺陷引起的病理现象，由于不同疾病可能仅反映某一因子的变化，因此一种特定试剂不可能对这些疾病的变化的敏感性一致。由于不同厂家生产的PT试剂质量不同，因此，同一份标本用不同PT试剂其结果可有明显的差异。因此PT实验最好采用INR的报告方式.

2.试剂准备过程中应该使用去离子水。如果pH值增高的水没有得到适当的缓冲，将会延长测定结果。如果用含氨的水配制抗凝剂，会导致V因子活性快速降低，从而延长凝血酶原时间。凝血活酶，部分活化凝血活酶，缓冲液和抗凝剂须在4-10℃条件下贮存，但在室温下保存氯化钙和水.

3.正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起，以弥补个体误差。正常对照血浆要求20份以上健康，年龄在18-55岁间的男女个体，且删除服药者，须在平静，休息状态抽血。样本离心取出血浆后混匀，分装小瓶，冻存于-80℃备用，或冷冻干燥.

4.参比血浆：标准化是质控的重要组成部分，方法标准化对有的实验室来说是困难的，因有设备条件方面的限制。为了使结果大同一实验室的不同时期具有可比性，必须使用标准品或参比血浆.WHO已建立了10多种国际标准品.

1.玻璃器皿的要求：贮存和测试时应选用干净，没有划痕的试管。酸清洗法(盐酸3mol/L)被公认为适用于凝血研究清洗玻璃制品的最佳方法。玻璃制品必须通过彻底冲洗，以去除残留的酸，避免改变容器表面的pH值。一次性玻璃和塑料制品分开保存。手工法PT或试管法全血凝固时间测定时，试管口径为8mm,直径越大,CT越长.

2.温度的要求：人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在(37±1)℃,并且周围照明设备要好，便于读取终点。如果为了读数而将试管从水浴箱中拿出，倾斜观察，此时动作应迅速，否则试管中的血浆温度将很快下降.

3.仪器的选择：自动终点测定法有半自动和全自动两种类型，区别在于前者在试剂和血浆移液步骤上仍是手工的；而后者完全由仪器自动操作。自动终点法测定所得结果重复性好，大大提高了不同试验室结果间的可比性.

应该根据仪器的精密度，可靠性，使用和维修的简易程度来选择所购买仪器。现在已有不少用合成底物法代替以凝固为终点的生物学测定法的报道。但是，这两种测定方法的临床意义不尽相同.

1.许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术，试剂，温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化。孵育时间与温度是在一期法凝血酶原时间测定时应严格控制的参数。血浆不能在37℃下放置超过10min,凝血活酶放置时间也不能超过说明规定的时限.

2.手工法PT或试管法CT检查时，倾斜试管动作一定要轻，角度要小，以减少血液与管壁的接触面积。同一标本要做二管(有文献报告试管法CT检查要3管)并取均值报告。每批实验必须有正常对照.

3.血液凝固主要是酶催化的反应，所以实验过程中要严格控制理想的pH环境和溶液的离子强度.多数常规试验都在处于血液生理pH值缓冲范围的缓冲系统中进行。反应混合物的pH值必须处于7.2-7.4之间.

4.试验结果准确还取决于所用的反应物的量，加入顺序和不同反应物的孵育时间。如每次APTT试验时，活化部分凝血活酶试剂和血浆混合物的孵育时间必须一致.混匀过程决定了APTT试验中接触活化的量，在孵育时如果在活化部分凝血活酶与血浆混合的技术不佳，将会改变测定结果。

5.APTT,PT需乏血小板血浆。一般3000r/min离心10min后分离血浆。离心前注意标本量，离心后注意血浆的量(Hct)以保证抗凝剂与标本量最适比例.

6.试验前检查血浆是否有溶血,黄疸,脂血和出现凝块.红细胞膜含有磷脂，溶血标本具有与血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性，这种磷脂能缩短溶血血浆的APTT值。标本中如果出现凝块，无论凝块多么小，均会影响试验结果.

7.报告方式:(1)以PT的秒(s)数报告.(2)以患者PT(s)/正常对照(s)的比(PTR)报告.(3)在口服药物治疗监控时以INR报告.(4)ICSH规定，不再用百分比(活动度)报告.(5)APTT以秒报告。

绘制质控图并随时分析其变化趋势是质量控制的重要手段。在每天工作中，同时测正常和氨基常对照血浆(商品或自制),并用Levey-Jeuny质控图检查有无失控。其步骤为，首先在常规的实验条件下(包括高素质的实验人员，规范的操作，稳定的仪器),对质控品至少进行10次测量，计算出X及标准差，然后绘出质控图，质控物的X值为基线，纵轴有X±2s.每次试验时质控物与标本一起检测，并把当日的结果点在图表上。下列的质量变化图形有利于操作人员判断结果是否有所失控。当失控时，按下述步骤(图1)检查原因.

室间质评：各实验室必须积极参加由检验中心组织的室间质评活动，以便了解本单位的结果准确性,因仪器和试剂不同，同一份质控血浆可行到不同结果，应将回报结果根据仪器试剂分组比较.

参考值

文献报道，手工法APTT的参考值为31.5-43.5s，女性为32-43s.两者无显著差异。

受检查的测定值较正常对照延长超过10s以上才有病理意义。手工法PT参考值为11-14s，超过正常对照3s为异常，PTR参考值为1±0.15.

因仪器、试剂的不同，会得到不同的结果，因此仪器法很难规定统一的参考值，各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或条件有变化时，根据新的条件，重新建立参考值。至少选择40名18-55岁之间男性及非妊娠，月经期女性(男女各半)、身体健康，半月内无服药史，在平静休息的状态采血且分开几天采血和测定(以减少批间差异).在常规检测示本的条件下进行试验。测定结果经统计学处理，计算标准差，取95%可信限为参考值范围。