荧光显微镜（研究细胞内物质吸收的仪器）
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更新时间：2023-05-19
荧光显微镜
研究细胞内物质吸收的仪器
基本信息
| 中文名 | 荧光显微镜 |
| 外文名 | Fluorescence microscope |
| 用途 | 研究细胞内物质的吸收、运输等 |
| 注意事项 | 在暗室中检查，按照说明书使用等 |
| 释义 | 物质进行定性和定量研究工具之一 |
| 光源 | 紫外线 |
收起
鉴别
工作原理
光源
荧光显微镜工作原理
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。
国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。
中国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。
滤色系统
滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；中国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。
1．激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。
紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。
激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。
2．压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应波长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：
紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上波长的光（绿到红），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，K510。
反光镜
反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。
聚光镜
1．明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。
2．暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。
3．相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。
物镜
各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大 时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。
目镜
在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。
落射光装置
CCD
使用范围
一般情况下，单独使用荧光显微镜即可以达到想要的成像效果，但在某些情况下，比如说当荧光比较微弱的情况下，仅仅通过荧光显微镜并不能达到理想的拍摄效果，或者大家希望可以将拍摄的荧光图片上传的电脑生面预览，修改甚至发表学术论文，这时候没有荧光显微镜CCD是不能达到要求的。
产品特点
荧光显微镜CCD一般具有良好的弱光捕捉能力，能够捕捉到极其微弱的荧光，因此成像能力好，此外，很多荧光冷CCD生产上搜对此类CCD作了制冷处理，使得此类CCD的噪音大大降低，信噪比得以很大的提高。由于其方便应用效果，此类CCD相机被广泛应用于荧光显微镜。
标本制作要求
荧光显微镜的标本制作要求
1、载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
2、盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用于涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起到不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本。
3、标本
组织切片或其他标本不能太厚，若太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。
4、封裱剂
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。
5、镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
使用方法
（1）打开灯源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。
（2）透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。
（3）用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。
（4）放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜油；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需待汞灯完全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。长时间的激发光照射标本，会使得荧光衰减和消失现象，故应尽可能缩短照射时间。暂时不观察时可用挡光板遮盖激发光。
（7）标本观察时候应采用无荧光油，应避免眼睛直视紫外光源。
研究发现
参考资料
[1]
国际最新研发出一低成本装置 可将智能手机转化成荧光显微镜 · 环球网[引用日期2023-03-10]
