CD33（CD33）

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更新时间：2023-05-22
CD33
CD33是髓系细胞分化抗原，分子量为67KD，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段。
基本信息
中文名
髓系细胞分化抗原
别名
CD33
分子量
67KD
主要分布
在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段
分布
髓系血细胞
定义
其胞内区含有免疫酪氨酸抑制基序（ITIM），所以它可能具有通过募集信号分子来调节细胞的生长与分化等功能。
特点
CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表达。在造血干细胞表面没有表达，在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达，因此CD33成为髓系白血病治疗的良好靶点。
增强抗肿瘤免疫
基本原理
有文献证实AML细胞表面免疫共刺激分子CD80表达低下或缺乏，是导致白血病细胞不能被机体细胞毒性T细胞（CTL）有效地识别杀伤，从而逃逸宿主免疫监视的重要原因之一，而T细胞也因缺乏第二信号而无能。因此可以利用CD33表面抗原作为AML白血病细胞的表面标记，构建CD80胞外区-抗人CD33单链抗体（ExCD80-CD33scFv）融合基因、表达融合蛋白，通过融合蛋白中抗人CD33scFv将CD80胞外区结合到AML白血病细胞表面，刺激肿瘤特异性CTL细胞活化，从而增强抗肿瘤免疫。
研究目的
构建及表达抗人CD33单链抗体（CD33scFv）基因，并检测其生物活性；扩增CD80胞外区，构建ExCD80-CD33scFv融合基因，并在大肠杆菌中表达融合蛋白，进一步检测融合蛋白的生物活性。
方法
HIM3-4是血研所研制的分泌鼠源性抗人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞，并已获得国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名。我们利用RT-PCR技术分别克隆了抗人CD33单克隆抗体HIM3-4的轻、重链可变区基因，并利用短肽（Gly4Ser）3作为linker,通过overlap PCR方法组装成抗人CD33scFv。将获得的抗体基因克隆到具有强启动子的PET28a（+）载体上，应用IPTG诱导表达，纯化的表达产物经证明具有与靶抗原人类CD33特异结合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠赠，我们通过另行设计带所需酶切位点的引物来扩增CD80胞外区，在此基础上，利用人血清白蛋白（HAS）第三结构域亲水性的403-427位氨基酸作为链间连接肽将抗人CD33单链抗体及人类细胞表面抗原CD80胞外区基因分别经酶切、纯化后克隆至原核表达载体PET22b（+）中，经IPTG诱导，在大肠杆菌内获得了融合蛋白的表达。融合蛋白的成功构建与表达，为下一步探讨血液肿瘤的免疫治疗机制奠定了基础。结果:1.通过RT-PCR方法，利用通用引物从HIM3-4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，分别为321bp和366bp，我们利用（GGGG）3为连接肽构建了抗人CD33基因工程单链抗体，并在PET28a（+）中得到表达，蛋白大小约为31KD,经复性后具有与人CD33结合活性。2克隆出CD80胞外区序列，大小为633bp。3利用大小为25Aa的链间链接肽，将CD80胞外区与CD33ScFv连为融合表达基因，并在PET22b（+）中得到表达，蛋白大小约为55KD,经复性后具有与人CD33抗原结合活性。
结论
1.
从HIM3-4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，经测序为功能性重排的抗体可变区基因。
2.
用（Gly4Ser）3连接肽基因将VH、VL连接成scFv基因，并用表达载体PET28a（+）表达了scFv蛋白。
3.
扩增了人类ExCD80 cDNA序列，测序显示序列正确。
4.
构建了PET22b（+）-ExCD80-CD33scFv融合基因表达质粒，并在含有稀有密码子的宿主菌Rosetta（DE3）中获得了表达。并初步探讨了其生物学功能。