融合蛋白（融合蛋白）

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更新时间：2023-05-19
融合蛋白
融合蛋白(fusion protein)有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。两个不同的蛋白质连成一个大分子。可以通过化学方法连接，也可以通过基因的融合来实现。
基本信息
中文名
融合蛋白
外文名
fusion protein
常见种类
免疫球蛋白（Ig）融合蛋白
连接方式
化学方法和基因融合
内容简介
融合蛋白图片
在基因操作中，对一些分子数小的多肽基因常采用融合的方法与某一基因（如lac）相连，二者之间接上某一酶（如凝血酶）的切口，以增加在体内表达后产物的稳定性，也有的故意使两个分子串连融合以提高疗效，如IL-3与GM-CSF。也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因，以使表达产物分泌到膜外或胞外。
融合蛋白-技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
技术特点
融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。
原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌比较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被传染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。
技术内容
基于重复结构的融合蛋白大多为短肽，不具有复杂的空间结构，因此只需简单的多肽合成过程即可获得目标蛋白。由单个氨基酸合成多肽主要通过两个氨基酸之间脱水形成肽键来实现，主要包括以下基本步骤:：首先对两性离子结构的氨基酸进行相应的氨基或羧基保护，其次将羧基活化为活性中间体，待耦合过程结束后，对肽链上氨基酸的保护基团选择相应的方式进行选择性的脱除或者是全脱除。目前常用的多肽合成方法为液相合成和固相合成两种。液相合成法是将所需的氨基酸配制成溶液，并对其中一个氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不参与反应的侧链基团进行化学基团保护，只活化参加反应的氨基酸的羧基，待耦合反应完成后再将没有参加反应的原料、活化剂等分离除去，得到纯化多肽产物。这种方法虽然操作繁琐，却具有目标产物纯度高的优势。而固相合成法，则是将多肽序列C端的第1个氨基酸的羧基通过酯化反应固定于不溶性的树脂上，进而以此氨基酸作为氨基组分，脱除其氨基保护基团并同过量的活化后的羧基组分耦合形成肽键，重复脱保护、缩合、洗涤过程持续合成，获得所需的肽链。合成完成后，再试用三氟乙酸将产物从树脂上切割下来，同时脱除所有保护基团，纯化回收获得所需多肽。
相对来说，具有一定空间结构且序列复杂的其他两种融合蛋白的合成过程则复杂得多。精确构建所需DNA模版是保证融合蛋白多样性及稳定性的基础。在获得目标DNA序列后，将其连接进入特定的载体之中，以获得充足融合蛋白质粒。由于遗传基因的简并性，同一种融合蛋白可对应着多种DNA序列，但序列合成蛋白效率却与扩增时选取的宿主种类有关(大肠杆菌、酵母菌及真核细胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出现在需要使用大肠杆菌表达体系的质粒中便会大大影响蛋白产率。重组质粒中密码子的优化还有许多影响因素，密码子偏倚、tRNA可用性、mRNA稳定性和mRNA结构都在基因表达中起重要作用，而且选择DNA片段时也应尽量避免在重组基因载体中存在高度重复的部分以避免发生错配，影响mRNA转录。
构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：
1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。
操作要点
在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列(Linker)，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。
一般来说，3-5个氨基酸的Linker可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的连接方式。另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。
遗憾的是，目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。
结构设计
构建融合蛋白的基本方法是将具有特定功能的天然或人工编码的多肽序列模块化，并使用基因编码的DNA序列模板合成，随后将第1个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第2个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。通过控制每一个功能肽模块在整体蛋白材料中的确切位置和密度，人们便能够根据实际需要改变融合蛋白的组成。
融合蛋白的设计大致分为基于重复结构、基于生长因子以及基于细胞粘附分子3类。第1类融合蛋白中最典型的是来源于弹性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及丝素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs) 的融合蛋白。ELPs是一种由数个重复的氨基酸序列组成的细胞外基质蛋白，由两种短肽段交替排列构成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5种。最著名的当属VPGZG融合蛋白(Z可换为除了脯氨酸外任意氨基酸)。重复的VPGVG序列能够使融合蛋白具有温敏特性，将温敏性ELP与化学、酶、物理等多种交联方式的水凝胶结合起来能够衍生出多种应用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，极易形成反向平行的β－折叠片层结构，具有多样侧链化学修饰位点，良好的热稳定性和机械性能，在生物医学上常用作手术缝合线，人工皮肤及软骨修复材料。对于此类融合蛋白，只需通过调节其氨基酸序列和分子链长度，便能够精确控制其对温度、pH、离子强度的响应敏感性，从而实现可逆的溶解转变。
临床应用
1、DNA疫苗
目前，疫苗已经经历了三代：第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统；第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答；第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基因来激活人体免疫系统，即DNA疫苗。
DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时诱导体液与细胞免疫应答。
目前利用基因工程成功制成的多价重组抗体融合蛋白CYF196(国内尚未上市)就是一种DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为CYF196对病毒的主要受体-位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有高度亲和力，对鼻病毒感染有较强的防御功能。
2、双功能酶（多功能酶）
以往研究发现，在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。
并且发现在这些新构建的融合蛋白中，蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比活力为50%-100%，对于催化连续反应的两种或几种酶，利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生“邻近效应”（proximity effect）。
目前研究发现，β-半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生NADH的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。
3、定向药物
定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。
4、基因表达
基因融合技术最早即是被用来在细菌（主要是大肠杆菌）中表达外源蛋白，如somatostatin4、insulin5等，对于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点，一是由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设计SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易。其二是外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白如β-半乳糖苷酶的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。
常见的几种
免疫球蛋白（Ig）融合蛋白
免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig不同片段相连，可将其分为二大类：一类为Fab(Fv)融合蛋白；另一类为Fc融合蛋白。
甲状旁腺激素（PTH）融合蛋白
甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，成熟PTH含84个氨基酸残基，分子量约为9500，是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化酶系统，增加胞浆内cAMP及焦磷酸盐(PPi)的水平来发挥作用。
细胞因子重组融合蛋白
细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。