双缩脲试剂（用于鉴定蛋白质的分析化学试剂）

VLoG
VLoG
次浏览
更新时间：2023-05-23
双缩脲试剂
用于鉴定蛋白质的分析化学试剂
双缩脲试剂是一种用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。它是一种碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1 g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01 g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制而成。
双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。当底物中含有肽键时，试液中的铜与多肽配位，络合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，会延长试剂的使用寿命。酒石酸钾钠的作用是保护反应生成的络离子不被析出变为沉淀，从而使试剂失效。
基本信息
中文名
双缩脲试剂
外文名
Biuret Reagent
应用
检测含肽键的物质，包括双缩脲，蛋白质等
主要成分
制作
0.1g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制而成
相关反应
双缩脲反应
收起
简介
血清蛋白测定(双缩脲法)试剂：球蛋白沉淀剂同上页酚试剂法。双缩脲试剂：硫酸铜(CuSO4·5H2O,三级试剂)1.5克，酒石酸钾钠(KNaC4H生O6·4H2O,三级试剂)6.0克2.5N氢氧化钠，300毫升，蒸馏水。将硫酸铜及酒石酸分别各以200毫升蒸馏水溶解，必要时过滤，全部倾入1,000毫升容量瓶中，混匀。再加入氢氧化钠溶液并以蒸馏水稀释至1,000毫升刻度。分装塑料或内壁涂蜡的试剂瓶，加塞密封，于室温保存。若溶液中出现暗红色沉淀即不宜再用。
反应原理
需要注意的是，能与双缩脲试剂发生紫色反应的化合物分子中至少含有两个肽键。因此，二肽无法用它来检验。
配制
双缩脲试剂A是质量分数为0.1 g/mL的NaOH水溶液；
双缩脲试剂B是质量分数为0.01 g/mL的CuSO4水溶液.
先在待测液中加入双缩脲试剂A 3mL，振荡均匀（营造碱性环境），再加入1～2滴双缩脲试剂B，振荡均匀。如果待测液里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。
蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫色的络合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
解释
双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成.
具体方法是
先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀，在加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。
应用
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=CC=O
HNNH
R-CHCH-R
O=CCuC=O
HNNH
R-CHCH-R
H2O
试剂作用
双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。
具体方法是：
先将双缩脲试剂A加入组织样液，振荡均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂B，振荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的络合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。
与双缩脲区别
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成
双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液；
双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。
双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在，遇蛋白质产生紫色。
简单的说，双缩脲是一种化学物质，而检测蛋白质用的那两个试剂之所以叫双缩脲试剂，是因为检测原理和双缩脲的形成相似。
方法学评价
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
优点：双缩脲法测定蛋白质的测定范围是1~10mg蛋白质，操作简单、快捷。既适合手工操作，又适合自动化分析，重复性好、线性关系好，双缩脲试剂可以长期保存（若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制）。
缺点：灵敏度差，测定范围窄，样品需要量大，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，因此它常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰测定的物质包括有：在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
注意事项
在使用双缩脲试剂时候，必须注意，必须是先加0.1g/mL氢氧化钠溶液，再加0.01g/mL硫酸
双缩脲试剂
铜的水溶液。(若先加入硫酸铜[CuSO4]溶液，再加入氢氧化钠[NaOH]溶液，则无法充分制造碱性环境，此时CuSO4会与NaOH发生复分解反应，生成蓝色氢氧化铜[Cu(OH)2]沉淀，导致现象不清，无法较好地达到实验目的.