免疫荧光（特异性强、敏感性高的标记技术）
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更新时间：2023-05-23
免疫荧光
特异性强、敏感性高的标记技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
技术特点
原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
直接法
将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
间接法
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
技术分类
⑴荧光抗体技术（荧光显微镜技术）
抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
⑵免疫荧光测定技术
抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
⑴荧光物质
1）荧光色素
⑴异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长520~530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
⑵四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：
⑵其他荧光物质
常见荧光素
1)FITC
2)RB200
3)TRITC
4）镧系：Eu、Tb
5)PE
6）其它
实验步骤
直接法测抗原
⑴基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
⑵试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜
玻片架
滤纸
37℃温箱等。
⑶实验步骤
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全复盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
⑷注意事项
1）对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3）为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4）一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
间接法测抗体
⑴基本原理
染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
⑵试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜
玻片架
滤纸
37℃温箱等。
⑶实验步骤
1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，复盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5）将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
6）重复操作3。
7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再复以盖玻片。
8）荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
⑷注意事项
1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2）每次试验时，需设置以下三种对照：
① 阳性对照：阳性血清+荧光标记物
③ 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
免疫荧光
