可溶性蛋白质(筛选抗性的指标之一)
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更新时间:2023-05-23
基本信息
中文名 | 可溶性蛋白质 |
外文名 | Soluble protein |
拼音 | kerongxingdanbaizhi |
特点 | 以小分子状态溶于水或其他溶剂 |
应用 | 植物生理、微生物 |
实验 | 考马斯亮蓝G-250法 |
收起
解释
测定
原理
考马斯亮蓝G-250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nM,后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内(1~100μg),蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2Min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏(灵敏度比FolIn-酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G-250和蛋白质通过范德华力结合,受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外,其他不同种类蛋白质染色强度差异不大),可测定微克级蛋白质含量,是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点,考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
操作方法
1?标准曲线(蛋白质含量为0~100μg/Ml)的绘制 取6支具塞试管,按表2-1数据配制含0~100μg/Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。
表2-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表
管号123456蛋白质标准液(ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水(ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量(μg)020406080100在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G-250溶液,盖塞,反转混合数次,放置2Min后,用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1.0Ml(样品提取见LoWry法),放入具塞试管中(每个样品设置两个重复),加入5Ml考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置2Min后在595nM下比色,记录吸光值,并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3.结果计算
式中C:查标准曲线值(μg);VT:提取液总体积(Ml);
FW:样品鲜重(g); V1:测定时加样量(Ml)。